Totally spies raconte les aventures de trois copines : Sam (la rousse), Clover (la blonde) et Alex (la brune). Ces 3 amies vivent à Beverly Hills, en Californie. Étudiantes dans la vie de tous les jours, elles sont en fait des agents secrets qui travaillent pour le WOOHP, une organisation secrète de protection de l'humanité.

Lorsque leur patron Jerry a besoin de leurs services, il les envoie en mission, après leur avoir fait revêtir des combinaisons intégrales moulantes en latex coloré (jaune pour Alex, rouge pour Clover et vert pour Sam) et leur fournit divers gadgets, qui les aideront à mener à bien leurs enquêtes.